Absorción del salbutamol: Estudios "in situ" e "in vitro". Influencia de los procesos de secreción

RESUMEN Se ha diseñado un protocolo de ensayos que permitiera profundizar en el conocimiento de los factores que modulan la incorporación del salbutamol al organismo tras su administración oral. Para ello se utilizaron distintas técnicas experimentales: perfusión in situ en animales, estudios difusionales en cultivos celulares y determinación del grado de expresión del gen MDR (portador de secreción intestinal) mediante biología molecular. Se han determinado las constantes aparentes de velocidad de absorción en intestino completo de rata de siete concentraciones diferentes de salbutamol, a fin de detectar la linealidad o no linealidad en su absorción. Con salbutamol 0.29 mM (dosis alométrica) se han realizado, en intestino delgado completo de la rata, ensayos de inhibición de sistemas activos de secreción intestinal. Se han utilizado el verapamilo, la azida sódica y el zumo de pomelo. También se ha estudiado la constante de velocidad de absorción in situ del salbutamol 0.29 mM, sólo y en presencia de verapamilo, en diferentes tramos del intestino delgado de la rata, a fin de establecer diferencias regionales de expresión del sistema secretor. Paralelamente, se ha analizado la expresión del gen MDR en diferentes tejidos, entre los que se encuentran dichos tramos intestinales, con el fin de comprobar si existe una correlación con los resultados obtenidos in situ. En los estudios de absorción in vitro se ha determinado la permeabilidad del salbutamol en monocapas celulares de Caco2-TC7 y MDCK en condiciones similares a las utilizadas para los estudios in situ. Del trabajo realizado se han extraído como más relevantes, las siguientes conclusiones: 1ª) La técnica de valoración utilizada para el salbutamol es plenamente satisfactoria dentro del ámbito de concentraciones ensayadas. 2ª) Las constantes aparentes de velocidad de absorción del salbutamol en intestino de rata determinadas en la Memoria son plenamente representativas del proceso de absorción del fármaco y no están modificadas por fenómenos de degradación del mismo. 3ª) La incorporación del salbutamol al organismo es dosis dependiente y viene definida por un proceso pasivo de entrada, simultáneo a un proceso de secreción activa desde las células absorbentes hacia el lumen intestinal. 4ª) El proceso de secreción del salbutamol desde el enterocito al lumen se inhibe competitivamente por el verapamilo lo que indica que, al menos en parte se halla mediatizado por la glicoproteína P. 5ª) La azida sódica aumenta ligeramente, de forma dosis-dependiente, los valores de las constantes de absorción del salbutamol, lo que indica que la secreción del fármaco es energía-dependiente. El hecho de que las constantes no difieran significativamente entre sí se atribuye a que la depleción de ATP no puede manifestarse adecuadamente en sólo 30 minutos. 6ª) El zumo de pomelo actúa como un inhibidor competitivo del sistema secretor. El efecto determinado es sólo cualitativo puesto que se desconoce qué sustancia/s son las responsables de la inhibición del proceso y su concentración en la solución de perfusión. 7ª) Tanto en células Caco2-TC7 como en las células MDCK, el cociente PBA/PAB es mayor que la unidad, lo que indica la existencia de transportadores que actúan en sentido basolateral-apical. En presencia de inhibidores específicos de los sistemas de secreción MDR y MRP, la reducción del valor del cociente ha sido semejante, por lo que se puede concluir que ambos sistemas están implicados por igual en el proceso de secreción activa del salbutamol. 8ª) La excelente correlación entre los ensayos de absorción in situ en los tramos intestinales y los niveles de expresión del RNA mensajero del gen MDR, determinados mediante RT-PCR, permiten concluir que la glicoproteína P se localiza preferentemente en el tramo distal del intestino delgado de la rata. 9ª) Para la administración oral del salbutamol sería conveniente adicionar un inhibidor específico de la glicoproteína P, que sea a su vez inocuo para el organismo, como podría ser la administración simultánea de zumo de pomelo, para evitar, de esta manera, la baja absorción del fármaco y poder obtener niveles plasmáticos que aseguren una respuesta terapéutica adecuada. También podría resultar adecuada una vía de administración alternativa que permitiera obviar los efectos de primer paso descritos. __________________________________________________________________________________________________ SUMARY Salbutamol was perfused in the rat small intestine using a standard rat gut in situ preparation: (1) in inhibitor-free solution at seven different concentrations (0.15, 0.29, 1.20, 5.0, 9.0, 13.0 and 18.0 mM); (2) at a 0.29 mM concentration thought to be close to the allometric dose in man in the presence of sodium azide (0.3, 3.0 and 6.0 mM); and (3) at 0.29 mM in the presence of verapamil (10.0 and 20.0 mM). In free solution, the mixed-order rate constants, k'a, of salbutamol increase as the solute concentration increases until an apparent asymptotic value is reached. In the presence of sodium azide the ka values increased about 1.5-fold, whereas in the presence of verapamil they increased 2- to 3-fold. These results indicate that salbutamol can act as a substrate of an intestinal secretory transport which probably includes at least in part the enzyme P-glycoprotein since verapamil has been shown to inhibit this enzyme by dose-dependent competition. The intrinsic absorption of salbutamol in different intestinal segments of the rat was measured and related with the corresponding intestinal P-gp expression levels. The apparent absorption rate constants (ka, h-1) observed in each fraction by means of the in situ method after perfusion of a 0.29 mM isotonic solution of salbutamol were used as absorption indexes. In a separate series of studies, a semiquantitative analysis of the mRNA expression of the P-gp by means of the polymerase-chain-reaction (PCR) The in situ ka values determined in the different segments (h-1) showed that the absorption is not homogeneous along the intestinal tract. Addition of verapamil to the perfusion fluid did provide a better absorption of salbutamol in the distal segment. The analysis of the mRNA expression and levels of P-gp showed that the enzyme content in each section of the intestine salbutamol absorption was inversely related to P-gp. Also experiments in vitro with Caco-2 TC7 and MDCK cells was realized to compared with the results obtained in situ. The same conditions were used. An inhibitor of the MRP systems (probenecid) was used in the Caco-2 TC7 cells